Xây dựng quy trình multiplex-PCR phát hiện các gen gây độc của nhóm vi khuẩn E.coli sinh độc tố Shiga (STEC) trong thực phẩm.

5 lượt xem

E. coli sinh độc tố Shiga (STEC) – STEC còn gọi là verocytotoxin – producing E. coli (VTEC) hoặc enterohemorrhagic E. coli (EHEC) là một trong sáu nhóm E. coli gây bệnh có liên quan đến các vụ ngộ độc thực phẩm. Nghiên cứu phát triển một kỹ thuật multiplex – PCR để xác định sự hiện diện cảu các gen stx1, stx2, eae và ehxA là cần thiết. Khảo sát...

Tóm tắt tiếng Việt: E. coli sinh độc tố Shiga (STEC) – STEC còn gọi là verocytotoxin – producing E. coli (VTEC) hoặc enterohemorrhagic E. coli (EHEC) là một trong sáu nhóm E. coli gây bệnh có liên quan đến các vụ ngộ độc thực phẩm. Nghiên cứu phát triển một kỹ thuật multiplex – PCR để xác định sự hiện diện cảu các gen stx1, stx2, eae và ehxA là cần thiết. Khảo sát điều kiện phản ứng multiplex – PCR, kết quả cho thấy, tách chiết DNA của chủng E. coli STEC bằng phương pháp sử dụng phenol/ chloroform hoặc đun sôi là như nhau. Thành phần của một phản ứng multiplex – PCR là 50 µl, trong đó hàm lượng bốn cặp mồi stx1: stx2: eae: ehxA với tỷ lệ 1: 1: 1: 2 (0,4: 0,4: 0,4: 0,8mM tương ứng), nồng độ MgCl2 là 3mM, Taq polymerase 5 µl (nồng độ 5u/l), nước cất không chứa ARN vừa đủ 50 µl. Chu kỳ nhiệt phản ứng; 95 độ C trong 5 phút, tiếp theo 25 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 94 độ C/30s, 54 độ C/30s vf 72 độ C/30s, bước cuối cùng 72 độ C/10 phút. Kích thước sản phẩm PCR là 306bp cho stxl, 482 bp cho stx2, 254bp cho eae, 138bp cho ehxA. Độ đặc hiệu và độ nhạy của quy trình multiplex – PCR này lần lượt là 100% và 96,7%. Quy trình này có thể được áp dụng trong các nghiên cứu dịch tễ học điều tra tỷ lệ gen độ trong ác chủng STEC cũng như trong điều tra nguyên nhân các vụ ngộ độc thực pahamr do vi khuẩn gây ra.

English summary: Shiga toxin-producing E. Coli (STEC) also known as verocytotoxin – producing E. Coli (VTEC) or enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) is one of the six pathotypes associated with food borne outbreaks. The study developed a multiplex – PCR procerdure that identified the presence of stxl (Shiga toxin 1) stx2 (Shiga toxin 2), eae (E. coli attaching and effacing) and ehxA (Enterohaemolysin) genes. Investigation of reaction conditions for multiplex – PCR, the result showed that DNA of STEC strains extracted by using phenol/ chloroform or boiling method was the same. Each 50 µl, multiplex – PCR reaction mixture contained the concentration of four primer pairs stx1: stx2: eae: ehxA with ratio 1: 1: 1: 2 (0,4: 0,4: 0,4: 0,8mM respectively), MgCl2 concentration is 3mM, Taq polymerase 5 µl (5u/ µl), enough 50 µl RNase-free water under the following conditions. 95 degree C for 5 min, 25 cycles, each cycle consisting of 94 degree C for 30s, 54 degree C for 30s and 72 degree C for 30s, plus a final extension step at 72 degree C for 10 m. The expected size of PCR amplicon was 306bp for stxl, 482 bp for stx2, 254bp for eae, 138bp for ehxA. Diagnostic specificity and sensitivity of multiplex – PCR were 100% and 96.7%, respectively. In conclusion, the protocol was successfully developed and it can be applied in epidemiological studies on prevalence of virulent genes in STEC strains as well as in investigation food born outbreaks.

Tin liên quan